新近發(fā)展起來(lái)的色譜法
    
     氣相色譜法是Martin和James于1952 年首先描述的，現(xiàn)已成為所有色譜法中zui和zui廣泛使用的一種方法，它特別適用于氣體混合物或揮發(fā)性液體和固體，即便對(duì)于很復(fù)雜的混合物，其分離時(shí)間也僅為幾分鐘左右，這已屬司空見(jiàn)慣。高分辯率、分析迅速和檢測(cè)靈敏等幾種優(yōu)點(diǎn)之綜合使氣相色譜法成了幾乎每個(gè)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室要采用的一種常規(guī)方法。近年來(lái)，因?yàn)樾滦鸵合嗌V儀和新型柱填料的發(fā)展以及對(duì)色譜理論的更深入了解，又重新引起對(duì)密閉柱液相色譜法的興趣。液相色譜法（High-Performance Liquid Chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC）迅速成為與氣相色譜法一樣廣泛使用的方法，對(duì)于迅速分離非揮發(fā)性的或熱不穩(wěn)定的試樣來(lái)說(shuō)，液相色譜法常常是更可取的。
     色譜法分類(lèi)
     色譜法有多種類(lèi)型，也有多種分類(lèi)方法。
    
     （一）按兩相所處的狀態(tài)分類(lèi)
    
     液體作為流動(dòng)相，稱為“液相色譜”（liquid chromatograp-hy）；用氣體作為流動(dòng)相，稱為“氣相色譜”（gas
     chromatogr-aphy）。固定相也有兩種狀態(tài)，以固體吸附劑作為固定相和以附載在固體上的液體作為固定相，所以層析法按兩相所處的狀態(tài)可以分為：
    
     液－固色譜（liquid-solid chromatography）
     液－液色譜（liquid-liquid chromatography）
     氣－固色譜（gas-solid chromatography）
     氣－液色譜（gas-liquid chromatography）
     （二）按層析過(guò)程的機(jī)理分類(lèi)
     吸附層析（adsorption chromatography ）利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。
    
     分配層析（partition chromatography）利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)（或溶解度）不同，而使之分離的方法。
     離子交換層析（ion-exchange chromatography ）利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同，而進(jìn)行分離的方法。凝膠層析（gelchromatography）利用某些凝膠對(duì)于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異，進(jìn)行分離的技術(shù)。
    
     （三）按操作形式不同分類(lèi)
     柱層析（colum chromatography）將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。紙層析（paper chrmatography）用濾紙作液體的載體（擔(dān)體support），點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析（thin layper chromatography）將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類(lèi)似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。
     吸附色譜法
     吸附色譜法常叫做液－固色譜法（Liquid-Solid
     Chromatography，簡(jiǎn)稱LSC），它是基于在溶質(zhì)和用作固定固體吸附劑上的固定活性位點(diǎn)之間的相互作用。可以將吸附劑裝填于柱中、覆蓋于板上、或浸漬于多孔濾紙中。吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，例如硅膠、氧化鋁和活性炭等。活性點(diǎn)位例如硅膠的表面硅烷醇，一般與待分離化合物的極性官能團(tuán)相互作用。分子的非極性部分（例如烴）對(duì)分離只有較小影響，所以液－固色譜法十分適于分離不同種類(lèi)的化合物（例如，分離醇類(lèi)與芳香烴）。
     分配色譜法
     在分配色譜法（也稱體液－液色譜法）中，溶質(zhì)分子在兩種不相混溶的液相即固定相和流動(dòng)相之間按照它們的相對(duì)溶解度進(jìn)行分配。固定相均勻地覆蓋于惰性載體─多孔的或非多孔的固體細(xì)?；蚨嗫准埳希埳献V）。為避免兩相的混合，兩種分配液體在極性上必須顯著不同。若固定液是極性的（例如乙二醇），流動(dòng)相是非極性的（例如乙烷），那么極性組分將較強(qiáng)烈的被保留。這是通常的操作方式。另一方面，若固定相是非極性的（例如癸烷），流動(dòng)相是極性的（例如水），則極性組分易分配于流動(dòng)相，從而洗脫得較快。后一種方法（它有相反的極性）稱作為反相液─液色譜法。由于溶解度差別的細(xì)微效應(yīng)，所以液─液色譜法很適于分離同系物的同分異構(gòu)體。在液─液色譜法中，固定相幾乎都被化學(xué)鍵合在載體物質(zhì)上，而不是機(jī)械覆蓋在它的表面。這種色譜法稱作鍵合相色譜法（Bonded-Phase Chromatography，簡(jiǎn)稱 BPC）。這種方法的機(jī)理尚不清楚，可能是分配機(jī)理，也可能是吸附機(jī)理， 視實(shí)驗(yàn)條件而定。液相色譜法中，鍵合相色譜法的應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)*其他模式。
     離子交換色譜法
     Sober 和 Peterson于1956年將離子交換基團(tuán)結(jié)合到纖維素上，制成了離子交換纖維素，成功地應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離。從此使生物大分子的分級(jí)分離方法取得了迅速的發(fā)展。離子交換基團(tuán)不但可結(jié)合到纖維上， 還可結(jié)合到交聯(lián)葡聚糖（S-ephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）上。
     近年來(lái)離子交換色譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體和多糖的分離和純化。它們的優(yōu)點(diǎn)是:⑴具有開(kāi)放性支持骨架，大分子可以自由進(jìn)入和迅速擴(kuò)散，故吸附容量大。⑵具有親水性，對(duì)大分子的吸附不大牢固，用溫和條件使可以洗脫，不致引起蛋白質(zhì)變性或酶的失活。⑶多孔性，表面積大、交換容量大，回收率高，可用于分離和制備。
     一、基本理論
    
     離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，如樹(shù)脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解離的基團(tuán)，這些基因在水溶液中能與溶液中的其它陽(yáng)離子或陰離子起交換作用。雖然交換反應(yīng)都是平衡反應(yīng)，但在層析柱上進(jìn)行時(shí)，由于連續(xù)添加新的交換溶液，平衡不斷按正方向進(jìn)行，直至*。因此可以把離子交換劑上的原子離子全部洗脫下來(lái)，同理，當(dāng)一定量的溶液通過(guò)交換柱時(shí)，由于溶液中的離子不斷被交換而波度逐減少，因此也可以全部被交換并吸附在樹(shù)脂上。如果有兩種以上的成分被交換吸著在離子交換劑上，用洗脫液洗脫時(shí)，在被洗脫的能力則決定于各自洗反應(yīng)的平衡常數(shù)。蛋白質(zhì)的離子交換過(guò)程有兩個(gè)階段──吸附和解吸附。吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)可以通過(guò)改變pH使吸附的蛋白質(zhì)失去電荷而達(dá)到解離但更多的是通過(guò)增加離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)離子交換劑上的電荷位置，使吸附的蛋白質(zhì)與離子交換劑解開(kāi)。不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成電鍵數(shù)目不同，即親和力大小有差異 ，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件便可將混合物中的組分逐個(gè)洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的。
     二、離子交換的分類(lèi)及常見(jiàn)種類(lèi)
     （一）分類(lèi)
     離子交換劑分為兩大類(lèi)，即陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。各類(lèi)交換劑根據(jù)其解離性大小，還可分為強(qiáng)、弱兩種，即 強(qiáng)酸劑　陽(yáng)離子交換劑
     　弱酸劑　強(qiáng)鹼型　陰離子交換劑　弱鹼型 。
     1.陽(yáng)離子交換劑
     　　陽(yáng)離子交換劑中的可解離基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、 羧酸（COOH）和酚羥基（-OH）等酸性基。
     某些交換劑在交換時(shí)反應(yīng)如下：
     強(qiáng)酸性：R-SO3 -H+ ＋ Na+ R-SO3- Na+H+
     弱酸性：R-COOH＋Na+ R-COONa ＋H+
     國(guó)產(chǎn)樹(shù)脂中強(qiáng)酸1×7（上海樹(shù)脂＃732）和國(guó)外產(chǎn)品Dowex 50、Zerolit 225等都于強(qiáng)酸型離子交換劑。
     2.陰離子交換劑
     　　陰離子交換劑中的可解離基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺[N-（CH3）2]和季胺[-N（CH3）2]等鹼性基團(tuán)。某些交換反應(yīng)如下：
     強(qiáng)鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH- ＋Cl R-N+（CH3）2 Cl＋OH-
     弱鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH- ＋Cl R-N+（CH3）2 HCl＋OH-
     強(qiáng)鹼性＃201號(hào)國(guó)產(chǎn)樹(shù)脂和國(guó)外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都屬于強(qiáng)鹼型陰離子交換劑。
     （二）種類(lèi)
     1.纖維素離子交換劑：陽(yáng)離子交換劑有羥甲基纖維素（CM-纖維素）， 陰離子交換劑有氯代三乙胺纖維紗（DESE-纖維素）。
     2.交聯(lián)葡聚糖離子交換劑：是將交換基因連接到交聯(lián)葡聚糖上制成的一類(lèi)交換劑，因而既具有離子交換作用，又具有分子篩效應(yīng)，是一類(lèi)廣泛應(yīng)用的色譜分離物質(zhì)。常用的Sephadex離子交換劑也有陰離子和陽(yáng)離子交換劑兩類(lèi)。陰離子交換劑有DEAE-Sephadex
     A-25，A-50和QAE- Sephadex A25 ， A50 ； 陽(yáng)離子交換劑有CM-Sephaetx
     C-50，C-50和Sephadex
     C-25，C-50。陰離子交換劑用英文字頭A，陽(yáng)離子交換劑的英文字頭是C。英文字后面的數(shù)字表示Sephadex型號(hào)。
     3.瓊脂糖離子離交換劑：是將DESE-或CM-基團(tuán)附著在Sepharose CL-6B
     上形成，DEAE-Sephades（陰離子）和CM-Sepharose（陽(yáng)離子），具有硬度大，
     性質(zhì)穩(wěn)定，凝膠后的流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
     三、實(shí)驗(yàn)操作
    
     （一）交換劑的處理，再生與轉(zhuǎn)型
     　　新出廠的樹(shù)脂是干樹(shù)脂，要用水浸透使之充分吸水膨脹。因其含有政績(jī)一些雜質(zhì)，所要要用水、酸、鹼洗滌。一般手續(xù)如下：新出廠干樹(shù)脂用水浸泡2
     小時(shí)后減抽壓去氣泡，傾去水，再用大量無(wú)離子水洗至澄清，去水后加4倍量2N HCl攪抖4小時(shí)，除去酸液，水洗到中性，再加4倍量2N
     NaOH攪抖4小時(shí)，除鹼液，
     水洗到中性備用。將樹(shù)脂帶上所希望的某種離子的操作稱為轉(zhuǎn)型。如希望陽(yáng)樹(shù)脂帶Na+，則用4倍量NaOH攪拌浸泡2小時(shí)以上；如希望樹(shù)脂帶H+，可用HCl處理。陰樹(shù)脂轉(zhuǎn)型也同樣，若希望帶Cl-則用HCl，希望帶OH-則用NaOH。用過(guò)的樹(shù)脂使其恢復(fù)原狀的方法稱為再生。并非每次再一都用酸、鹼液洗滌，往往只要轉(zhuǎn)型處理就行了。
     （二）柱上操作
     ⑴交換劑裝柱zui簡(jiǎn)單的交換層析柱可用鹼式滴定管代替。處理過(guò)的樹(shù)脂放入燒杯，加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管中，使樹(shù)脂緩慢沉降。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻。
     ⑵上樣向?qū)游鲋鶅?nèi)傾入樣品液
     ⑶洗脫與收集
     　　不同樣品選用的洗脫液不同。原則是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子，把吸著物交換出來(lái)。由于被吸著的物質(zhì)往往不是我們所要求的單一物質(zhì)，因此除了正確選擇洗脫液外還采控制流速和分布收集的方法來(lái)獲得所需的單一物質(zhì)。
     膠色譜法
     　　凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而又簡(jiǎn)單的分離分技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果。目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。
     一、基本理論
     （一）分子篩效益
     　　一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時(shí)，各分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行著兩種不同的運(yùn)動(dòng)：垂直向下的移動(dòng)和無(wú)定向的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動(dòng)的過(guò)程中，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子zui小的zui后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有zui大極限和zui小極限。分子直徑比凝膠zui大孔隙直徑大的，就會(huì)全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠zui小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進(jìn)入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會(huì)有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所述，在凝膠色譜中會(huì)有三種情況，一是分子很小，能進(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙；二是分子很大，*不能進(jìn)入凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分。大、中、小三類(lèi)分子彼此間較易分開(kāi)，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類(lèi)的情況下是很難分離的。對(duì)于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子的可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動(dòng)距離較短，分子較小的移動(dòng)距離較長(zhǎng)。于是分子較大的先通過(guò)凝膠床而分子較小的后通過(guò)凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大的分子在通過(guò)這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時(shí)阻力較大，小分子通過(guò)時(shí)阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過(guò)凝膠床時(shí)，按照分子量大小“排隊(duì)，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。
     （二）色譜柱的重要參數(shù)
     ⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt
     表示。
     ⑵外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。
     ⑶內(nèi)水體積：因?yàn)槟z為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。
     不包括固體支持物的體積（Vg）。
     ⑷峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過(guò)凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve
     表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時(shí)，（與洗脫體積比較可以忽略不計(jì)），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。
     當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從應(yīng)用樣品開(kāi)始到洗脫峰升高的彎曲點(diǎn)（或半高處）。
    
    
    
     二、凝膠的種類(lèi)及性質(zhì)
     （一）交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）
     ⑴Sephadex
     G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephndex，不同規(guī)格型號(hào)的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類(lèi)有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。
     ⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。
     （二）瓊脂糖凝膠：
     　　商品名很多，常見(jiàn)的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美國(guó)Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級(jí)鏈如氫鍵來(lái)維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開(kāi)始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。
     （三）聚丙烯酰胺凝膠：
     　　是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，
     由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P
     （Bio-Gel P），由美國(guó)Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號(hào)很多，從P-2至P-300共10種，P
     后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。
     （四）聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel ， 具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，
     可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測(cè)定和脂溶性天然物的分級(jí)，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，洗脫劑可用甲基亞砜。
     三、實(shí)驗(yàn)技術(shù)
     （一）層析柱
     層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時(shí)應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，
     直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過(guò)高擠壓變形阻塞，一般不超過(guò)1米。分族分離時(shí)用短柱，一般凝膠柱長(zhǎng)20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。
     分級(jí)分離時(shí)柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力。在分離時(shí)，死體積不能超過(guò)總床體積的1/1000。
     （二）凝膠的選擇 根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。 一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex
     G-20的吸水量為20，1 克Sephadex
     G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實(shí)驗(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200號(hào)篩目的的Sephadex
     G-200效果好， 脫鹽用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。
     （三）凝膠的制備
     商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時(shí)內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時(shí)，
     自然膨脹需24小時(shí)至數(shù)天，而用加熱法在幾小時(shí)內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。
     （四）樣品溶液的處理 樣品溶液如有沉淀應(yīng)過(guò)濾或離心除去，如含脂類(lèi)可高速離心或通過(guò)Sephadex
     G-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過(guò)4％，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。
     分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。
     （五）防止微生物的污染 交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類(lèi)物質(zhì)，防止微生物的生長(zhǎng)，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:
     ⑴疊氨鈉（NaN3）在凝膠層析中只要用0.02％疊氮鈉已足夠防止微生物的生長(zhǎng)，疊氮鈉易溶一水，在20℃時(shí)約為40％；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會(huì)改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。
     ⑵可樂(lè)酮[Cl3C-C（OH）（CH3）2]在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的殺菌效果*，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60℃時(shí)易引起分解而失效。
     ⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉 在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01％。在微酸性溶液中zui為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。
     ⑷苯基汞代鹽
     在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01％。在微堿性溶液中抑效果*，長(zhǎng)時(shí)間放置時(shí)可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。
     親和色譜法
     一、基本理論
     （一）原理
     　　在生物體內(nèi)，許多大分子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有與某些相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性。例如抗原和抗體、酶和底物及輔酶、激素和受體、RNA和其互補(bǔ)的DNA等，都具有這種特性。生物分子之間這種特異的結(jié)合能力稱為親和力，根據(jù)生物分子間親和吸附和解離的原理，建立起來(lái)的色譜法稱親色譜法。親和色譜中兩個(gè)進(jìn)行專一結(jié)合的分子互稱對(duì)方為配基。如抗原和抗體，抗原可認(rèn)為是抗體的配基，反之抗體也可認(rèn)為是抗原的配基。將一個(gè)水溶性配基在不傷害其生物學(xué)功能的情況下與水不溶性載體結(jié)合稱為配基的固相化。親和色譜法的基本過(guò)程是：
     1.配基固相化。將與純化對(duì)象有專一結(jié)合作用的物質(zhì)，連接在水不溶性載體上，制成親和吸附劑后裝柱（稱親和性）。
     2.親和吸附。將含有純化對(duì)象的混合物通過(guò)親和柱，純化對(duì)象吸附在柱上，其他物質(zhì)流出色譜柱。
     3.解吸附。用某種緩沖液或溶液通過(guò)親和柱，把吸附在親和柱上的欲純化物質(zhì)洗脫出來(lái)。
     （二）應(yīng)用范圍
     親和色譜可用于下列生物體系：
     酶：底物、抑制劑、輔酶
     抗體：抗原、病毒、細(xì)胞
     外源凝集素：多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體、
     細(xì)胞核酸：互補(bǔ)堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶 、結(jié)合蛋白
     激素及維生素：受體、載體蛋白
     細(xì)胞：細(xì)胞表面特異蛋白、外源凝集素
     親和色譜的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、效率高、條件溫和，缺點(diǎn)是使用局限性大。
     （三）載體的選擇原則
     　　
     　　
     用于親和色譜的理想載體應(yīng)具有下列特性：⑴不溶性：不溶于水；⑵滲透性：疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，容許大分子自由通過(guò)；⑶有一定硬度，為均一的珠狀；⑷具有大量可供反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，能與大量配基共價(jià)連接；⑸非特異性吸附能力極低；⑹能抗微生物和酶的侵蝕；⑺有較好的化學(xué)穩(wěn)定性；⑻親水性。選擇配基根據(jù)對(duì)純化大分子的特異性的全面認(rèn)識(shí)。
     選擇也的配基有兩條標(biāo)準(zhǔn)：
     *是蛋白質(zhì)和配基之間必須有強(qiáng)的親和力，解離常數(shù)在5mM以上不是好配基；
     相反親和力太高也是有害的，因?yàn)樵诮怆x蛋白質(zhì)──配基復(fù)合物時(shí)所需的條件就要強(qiáng)烈，這樣可能使蛋白質(zhì)變性。例如用抗生物素蛋白作配基純化含生物素的羧化酶時(shí)，生物素──抗生物素蛋白復(fù)合物的解離常數(shù)達(dá)10-15M，解離時(shí)需要pH1.5，6M鹽酸胍，在這種條件中。羧化酶大多數(shù)已經(jīng)變性。
     選擇配基的第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是，配基必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，這種基團(tuán)不參與配基與蛋白質(zhì)之間特異結(jié)合，但可用于活化和載體相連接，同時(shí)又不影響配基與蛋白質(zhì)之間的親和力。
     （四）常見(jiàn)載體的特性
     瓊脂糖凝膠： 親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定 （商品名：Sepharose）
     聚丙烯酰胺凝膠： 理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐有機(jī)溶劑及去污劑， 抗微生物能力強(qiáng)， 特別適應(yīng)用配基與提取物親和力比較弱的物質(zhì)。
     葡聚糖凝膠： 有良好的化學(xué)及物理性質(zhì)，孔經(jīng)小。
     纖維素： 非特易吸附嚴(yán)重，廉價(jià)，易得。
     二、實(shí)驗(yàn)方法
     親和色譜分離的方法隨每種分離物質(zhì)的不同而有不同。一般推薦使用的程序如下：
     1選 擇 配 基；2選擇偶聯(lián)凝膠；3偶 聯(lián) 配 基；4裝填合適的柱；5平衡（2-3倍體積緩沖液）；6應(yīng) 用 樣
     品；7洗滌未結(jié)合物質(zhì)；8洗脫結(jié)合物質(zhì)→除鹽；9再生　
     高壓液相色譜
     　　Martin 和
     Synge在1941年就提出相色譜的設(shè)想，然而直到六十年代后期，由于各種技術(shù)的發(fā)展，液相色譜才付諸實(shí)現(xiàn)。這種色譜技術(shù)曾被稱為高速液相色譜（HighSpeed
     Liquid Chromatography），高壓液相色譜（High Parss-ure Lipuid Chromatography），目前使用zui多的名稱是液相色譜（High Pe-rformance Liauid
     Chromatography，HPLC）。液相色譜已經(jīng)廣泛地應(yīng)用，成為一項(xiàng)*的技術(shù)。它的主要優(yōu)點(diǎn)是⑴分辯率高于其它色譜法；⑵速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成；⑶重復(fù)性高；⑷相色譜柱可反復(fù)使用；⑸自動(dòng)化操作，分析度高。根據(jù)分離過(guò)程中溶質(zhì)分子與固定相相互作用的差別，液相色譜可分為四個(gè)基本類(lèi)型，即液－固色譜、液－液色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。液相色譜在生物領(lǐng)域中廣泛用于下列產(chǎn)物的分離和鑒定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有機(jī)酸；⑶甾體化合物；⑷生物鹼；⑸抗菌素；⑹糖類(lèi)；⑺卟啉；⑻核酸及其降解產(chǎn)物；⑼蛋白質(zhì)、酶和多肽；⑽脂
    
     一、分類(lèi)
     　　液相色譜法可分為四個(gè)基本類(lèi)型：即液－固色譜法，鍵合相色譜法，離子交換色譜法及體積排阻色譜法。
     （一）液－固色譜法
     　　液－固色譜法通常稱吸附色譜法，吸附劑有活性碳，氧化鋁和硅膠，在液－固色譜法中用的載體都是硅膠。硅膠對(duì)溶質(zhì)，分子的吸附能力不是平均分布在整個(gè)硅脫表面的，在硅膠表面有一些區(qū)域與溶質(zhì)分子強(qiáng)烈相互作用，這些區(qū)域?yàn)榛钚晕恢?，硅膠與溶質(zhì)分子間主要作用是偶極距力氫鍵及靜電相互作用。極性越強(qiáng)，而化合物在硅膠柱上的滯留時(shí)間也長(zhǎng)。在液－固色譜中，依靠流動(dòng)相溶劑分子與溶質(zhì)分子競(jìng)爭(zhēng)固定相互活性位置，
     從而使溶質(zhì)從色譜柱上洗脫下來(lái)。與硅膠表面活性位置結(jié)合力強(qiáng)的溶劑洗脫溶質(zhì)分子的能力強(qiáng)，因而稱強(qiáng)溶劑，反之為弱溶劑。液─固色譜法的特點(diǎn)是適于分離色譜幾何異構(gòu)體，可用于脂溶性化合物質(zhì)如磷脂，甾體化合物，脂溶性維生素，前列腺素等。
     （二）鍵合相色譜法
     　　鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發(fā)展起來(lái)的。鍵合相色譜法將固定相共價(jià)結(jié)合在載體顆粒上，克服了分配色譜中由于固定相在流動(dòng)中有微量溶解，及流動(dòng)相通過(guò)色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊，固定相不斷損失，色譜柱的性質(zhì)逐漸改變等缺點(diǎn)。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。
     1.正常相色譜法
     　　在正常相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的基團(tuán)都是極性基團(tuán)，如一級(jí)氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動(dòng)相溶劑是與吸附色譜中的流動(dòng)相很相似的非極性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是極性，因此流動(dòng)溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力也越強(qiáng)，即極性大的溶劑是強(qiáng)溶劑。固定相與流動(dòng)相的這種關(guān)系正好與液－固色譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動(dòng)相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離，它不適于分離幾何異構(gòu)體。
     2.反相色譜法
     　　在反相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的固定相是一些直鏈碳?xì)浠衔?，如正辛基等。流?dòng)相的極性比固定相的極性強(qiáng)。反相色譜法在液相色譜法中應(yīng)用zui廣泛。
     在反相色譜法中，使溶質(zhì)滯留的主要作用是疏水作用，在液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當(dāng)水中存在非極性溶質(zhì)時(shí)，溶質(zhì)分子之間的相互作用 、溶質(zhì)分子與水分子之間的相互作用遠(yuǎn)小于水分子之間的相互作用，
     因此溶質(zhì)分子從水中被“擠”了出去?？梢?jiàn)反相色譜中疏水性越強(qiáng)的化合物越容易從流動(dòng)相中擠出去，在色譜柱中滯留時(shí)間也長(zhǎng)，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到分離。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團(tuán)的化合物，亦即非極性基團(tuán)的化合物。此外，反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團(tuán)的化合物。可以通過(guò)改變流動(dòng)相的溶劑及其組成和pH，以影響溶質(zhì)分子與流動(dòng)相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水的流動(dòng)相中占的比例伸縮性很大，可以／從0-100％，從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色譜法中的固定相是被共價(jià)結(jié)合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴，其鏈的長(zhǎng)短不同，zui長(zhǎng)的是十八烷基，這也是使用得zui多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳?xì)滏湹拈L(zhǎng)度而增加，在反相色譜柱中溶質(zhì)由于疏水作用而滯留的時(shí)間也將隨著碳?xì)滏湹拈L(zhǎng)度而增加。在一般情況下這意味著用碳?xì)滏滈L(zhǎng)的反相色譜柱能得到較好的分辯率，在多數(shù)情況下是依靠反復(fù)來(lái)選擇色譜柱。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳?xì)浠衔?，溶質(zhì)與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說(shuō)疏水相互作用，因此溶劑的強(qiáng)度隨著極性降低而增加。水是極性zui強(qiáng)的溶劑，也是反相色譜中zui弱的溶劑。在反相色譜中常常用和基礎(chǔ)溶劑，向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑，以得到不同強(qiáng)度的流動(dòng)相，這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中zui常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈，此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。
     在生化分析中，反相色譜的應(yīng)用極廣?？捎糜冖侔被岷投嚯牡姆治?；②蛋白質(zhì)的分離；③堿基，核酸和核酸酶的分析；④甾體化合物的分析；⑤以及其他如幾茶酚胺類(lèi)，組胺，糖及維生素的分離。
     （三）離子交換色譜
     　　離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)，
     這些帶電基團(tuán)通過(guò)靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動(dòng)相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質(zhì)量作用定律，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。固定相基團(tuán)帶正電荷的時(shí)候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電荷，可用來(lái)與流動(dòng)相交換的離子就是陽(yáng)離子，這種離子交換劑叫做陽(yáng)離子交換劑。陰離子交換柱的功能團(tuán)主要是－NH2，及－MH3+：陽(yáng)離子交換劑的功能團(tuán)主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3+離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬于強(qiáng)離子交換劑，它們?cè)诤軓V泛的pH范圍內(nèi)都有離子交換能力；-NH2及-COOH
     離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的pH值范圍內(nèi)，才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動(dòng)分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。
    
     二、易出現(xiàn)的問(wèn)題
    
     （一）渦流擴(kuò)散（Eddy diffusion）
     　　流動(dòng)相碰到較大的固體顆粒，就像流水碰到石頭一樣產(chǎn)生渦流。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細(xì)溝，則流動(dòng)相的速度就快；有的部位結(jié)塊或裝直緊密則流就慢，多條流路有快有慢，就使區(qū)帶變寬。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，裝柱要松緊均一，這樣渦流擴(kuò)散小，柱效率高。
     （二）分子擴(kuò)散（Molecular diffusion）
     　　分子擴(kuò)散就是物質(zhì)分子由濃度高的區(qū)域向濃度低的區(qū)域運(yùn)動(dòng)，也稱縱向分子擴(kuò)散。要減少分子擴(kuò)散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時(shí)在操作時(shí)，如果流速太慢，被分離物質(zhì)停留時(shí)間長(zhǎng)，則擴(kuò)散嚴(yán)重。
     （三）質(zhì)量轉(zhuǎn)移（Mass transfer）
     　　被分離物質(zhì)要在流動(dòng)相與固定相中平衡，這樣才能形成較窄的區(qū)帶。在液相色譜中，溶質(zhì)分子要在兩個(gè)液相之間進(jìn)行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時(shí)間。當(dāng)流速快時(shí)，轉(zhuǎn)移速度慢，來(lái)不及達(dá)到平衡動(dòng)相就向前移，這各物質(zhì)的非平衡移動(dòng)，使區(qū)帶變寬。
     （四）動(dòng)相流速
     　　當(dāng)流速太低時(shí)，分子擴(kuò)散嚴(yán)重，特別是在氣相色譜中尤為突出。如將理論塔板高度對(duì)流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降，當(dāng)達(dá)到zui低值時(shí)，流速再加大則質(zhì)量轉(zhuǎn)移起主要作用，理論塔板高度又加大。在液相色譜中，流速稍快影響不大，但在凝膠過(guò)濾色譜中，因?yàn)槲镔|(zhì)要滲透到凝膠內(nèi)部，所以質(zhì)量轉(zhuǎn)移影響大，流速咖大會(huì)降低柱效率。
     （五）固定相顆粒大小
     　　定相顆粒越小柱效率越高，對(duì)流動(dòng)相流動(dòng)的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動(dòng)。